Canales voltaje-dependientes de Ca2+ Tipo-L

Estructura del canal
Subunidad α
Subunidades β
Cinética del canal
Regulación del canal
Canalopatías
Referencias


En cardiomiocitos en reposo, la concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) es 20.000 veces menor que su concentración en el medio extracelular (<0.1 μM vs 1-2 mM) y el interior celular es electronegativo (-50 a -90 mV). Es decir, que existe un gradiente electroquímico que favorece la entrada de iones Ca2+ en la célula. Durante la activación celular, la [Ca2+]i aumenta hasta 0.3-1 μM como consecuencia de la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular a través de la membrana, bien a través de canales voltaje dependientes tipo-L (y, en mucho menor grado, del intercambiador Na+-Ca2+) y/o de la liberación de Ca2+ desde sus depósitos intracelulares, principalmente el retículo sarcoplásmico reticulum (Ca2+ induced Ca2+ release).

La entrada de Ca2+ a través de los canales tipo-L de las células cardiacas genera una corriente de entrada de Ca2+ (ICa) que regula el acoplamiento excitación-contracción, la liberación de neurotransmisores, la secreción de hormonas y la expresión de genes, la fase 0 de despolarización en las células de los nodos sinoauriculares (SA) y atrioventriculares (AV), la frecuencia de disparo del NSA, la velocidad de conducción a través del nódulo AV y la fase de meseta del potencial de acción cardíaco (Zamponi et al., 2015). Además, un aumento patológico de la ICaL está involucrado en ciertas formas de actividad arritmogénica focal, incluido el automatismo anormal en fibras cardíacas isquémicas-despolarizadas y los pospotenciales tempranos generados en situaciones en las que se prolonga la duración del intervalo QT del ECG).

Estructura del canal

Los canales de Ca2+ voltaje-dependientes tipo-L son heterotetrámeros compuestos por 4 subunidades: una subunidad α1C que forma el poro del canal (1C o 1D, 242 kDa) y distintas subunidades auxiliares, incluídas el dímero α2/δ (175 kDa) unidas por un puente disulfuro y las subunidades β1-3 (55-60 kDa) intracelulares (Figura) (Nerbonne y Kass, 2005; Bodi et al., 2005). Estas subunidades se condifican, respectivamente, por los genes CACNA1C o CACNA1D, CACNA2D1 o CACNA2D3 y CACNB1-3 (Nerbonne y Kass, 2005; Bodi et al., 2005). Las subunidades β están estrechamente asociadas en la cara citoplásmica de la subunidad α1 (a través del lazo que une los dominios I-II), mientras que las subunidades α2δ están ancladas a la membrana plasmática e interactúan con dominios extracelulares de la sububidad α1.

Subunidad α1C

(Cav1.2). Está formada por 2179 aminoácidos que se organizan en 4 dominios homólogos (DI-DIV), cada uno de los cuales está compuesto por 6 segmentos transmembrana (S1-S6). Esta subunidad contiene el poro iónico, que está formado por el lazo P que une S5 y S6 en cada dominio y penetra en la membrana, el filtro de selectividad, los mecanismos que regulan la cinética de apertura y cierre del canal y los puntos de unión para la subunidad α y para los bloqueantes de los canales de Ca2+ (IIIS5, III6 andIVS6). Al igual que el canal de Na+ voltaje-dependiente, se cree que la α-hélice del S4, que contiene varios residuos con cargas positivas, forma el sensor de voltaje, que se mueve en el campo transmembrana iniciando unos cambios conformacionales que modulan la condutancia del canal (Bezanilla, 2002, Caterall, 2000). El análisis estructural ha permitido ientificar una serie de cinco sitios de unión para Ca2+, que van desde la entrada al vestíbulo exterior a través del filtro de selectividad hasta la cavidad central (Tang et al., 2014). Este hallazgo es cosnistente con un mecanismo knock-off, en el cual la unión de un ion Ca2+ bloquea el poro y evita la entrada de cationes monovalentes, mientras que la unión de un segundo Ca2+ a un segundo sitio de unión de Ca2+ induce la repulsión electrostática que empuja el primer Ca2+ unido a través del filtro de selectividad hacia el citosol. Este mecanismo explica cómo el canal de Ca2+ es altamente selectivo con respecto a otros cationes monovalentes y presenta una alta conductancia para el Ca2+, aunque los diámetros atómicos de Na+ y Ca2+ son casi idénticos (Caterall y Swanson, 2015).

La interacción entre las subunidades α1 y la β citoplasmática se ha propuesto que se realiza entre dos regiones conservadas: el dominio de interacción (BID) de la subunidad β y el dominio de interacción AID localizado entre los dominios DI y DII de la subunidad α1 (De Waard et al., 1994; Pragnell et al., 1994). Sin embargo, el dominio BID está enterrado en el canal y no está disponible para que se produzca una interacción proteína-proteína. Evidencia reciente indica que la subunidad β eng se une con la AID a través de una hendidura hidrófoba extensa y conservada denominada el bolsillo de unión α (α-binding pocket, ABP) (Van Petegem et al ., 2004).

La interacción ABP-AID coloca un extremo de la subunidad β cerca del extremo intracelular de un segmento que reviste el poro denominado IS6, que desempeña un papel crítico en múltiples propiedades de canal, como la activación dependiente de voltaje, la velocidad de inactivación, la modulación de proteínas G, la sensibilidad a fármacos y la expresión de los canales en la superficie celular. Los posibles sitios de interacción entre la subunidad α y el receptor-canal de rianodina (RyR2) del retículo sarcoplásmico se localizan en el lazo intracitoplasmático entre DII y DIII. La subunidad α 1C también contiene los sitios de unión para los bloqueantes de los canales de Ca2+.

El largo extremo C-terminal (1854-1921) es un importante dominio modulador y está implicado numerosas interacciones proteína-proteína. Contiene 5 serinas que facilitan su fosforilación por la PKA y la CAMKII, una mano EF (dominio estructural de proteínas de tipo hélice-bucle-hélice que se encuentra en una gran familia de proteínas de unión a Ca2+), sitios de unión para la calmodulina quinasa II (CaMKII) y la proteína fosfatasa 2A y un motivo de unión de calmodulina (CaM) Ca2+-dependiente formado por la secuencia isoleucina-glutámico (IQ), que está implicado en la autorregulación del canal (Zuhlke, et al., 1999; Bodi et al., 2005). El extremo C-terminal contiene un dominio modulador que interfiere con la modulación de la calmodulina (CaM). Este modulador consta de dos supuestas hélices α: una en el extremo C-terminal (denominada DCRD) y otra inmediatamente después del sitio principal de interacción de la CaM (PCRD), el llamado motivo IQ. Tras su unión al Ca2+ la calmodulina sufre un cambio conformacional que promueve la inactivación Ca2-dependiente del canal (Christel y Lee, 2012). Este es un importante mecanismo autoinhibitorio que impide la entrada excesiva de Ca2+. Al igual que la inactivación voltaje-dependiente que ocurre durante la despolarización, la inactivación Ca2-dependiente parece implicar reordenamientos conformacionales de la boca intracelular del canal. La substitución de la isoleucina 1624 por una alanina previene la unión de la calmodulina y elimina la inactivación Ca2+-dependiente del canal (Zuhlke et al., 1999).

La proteína de anclaje asociada a la proteína cinasa A (AKAP15) inteactúa con el extremo C-terminal a través de un motivo cremallera de leucina (leucine zipper) conservado y se une a la PKA cerca del sitio de fosforilación (serine1928) para la proteína cinasa dependiente de AMPc (PKA) (Hulme JT 2003). La activación de los receptores β-adrenérgicos aumenta marcadamente la ICaL a través de los canales Cav1.2, lo que requiere su fosforilación por la PKA a través de la AKAP15. La disrupción del anclaje de la PKA a los canales Cav1.2 inhibe marcadamente su regulación a través de la vía de la PKA y la regulación β-adrenérgica de los mismos en los miocitos ventriculares. El extremo C-terminal se escinde de la subunidad α1 y puede formar un complejo con la subunidad truncada α1C a través de los dominios reguladores proximal y distal (PCRD y DCRD), actuando como un potente dominio de autoinhibición. La formación del complejo de autoinhibición reduce en gran medida la eficiencia de acoplamiento del sensor de voltaje y la apertura del canal y desplaza la dependencia de voltaje del proceso de activación a potenciales más positivos (Hulme JT 2006). El segmento N-terminal contiene un punto de fosforilación para la PKC y un punto de unión con la subunidad β (AID).

Subunidades β

Se han identificado 4 subunidades β (β1-4, 55 kDa) codificadas por los genes CACNB1, CACNB2, CACNB3, y CACNB4, respectivamente. En general, la coexpresión de las subunidades β modula las propiedades biofísicas de las subunidades α1, produciendo un desplazamiento hacia la izquierda de la relación corriente-voltaje y regulan la expresión del canal en la superficie de la membrana celular.

La subunidad β2 parece ser la más se expresa en el corazón (Pérez-Reyes et al., 1992). Su interacción con la subunidad α1 se realiza a través de motivos de secuencia bien definidos localizados en la subunidad β (BID, β subunits interaction domain) y una secuencia altamente conservado en las subunidades α1 (AID o alpha subunit interaction domain) ubicado en el lazo intracitoplasmático entre DI y DII (Pragnell et al., 1994). La coexpresión de las subunidades α1 y β conduce a un aumento de hasta 10 veces en la densidad de ICa al aumentar tanto la expresión del canal de la superficie celular como la probabilidad de apertura del mismo, estabiliza los complejos α1 y β en la membrana celular, acelera la activación del canal y la cinética de inactivación, aumenta el número de sitios de unión de alta afinidad para las dihidropiridinas y participa en la modulación del canal de Ca2+ inducido por la estimulación β-adrenérgica (Mikala et al., 1998, Yamaguchi et al., 1998; Wei et al., 2000). La subunidad β, además, antagoniza una señal de retención del retículo endoplásmico situada en el lazo DI-DII de la subunidades α1, facilitando el tráfico intracelular de subunidades α1C hacia la membrana plasmática y su correcta inserción a este nivel (Yamagichi et al., 1998; Bichet et al., 2000). La fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K) aumenta la ICaL al promover la translocación de los canales de Ca2 + a la membrana, un efecto que requiere específicamente de la presencia de subunidades β2 (Viard et al., 2004).

La subunidad β2δ (143 kDa), codificada por los genes CACNA2D1, CACNA2D2, CACNA2D3 y CACNA2D4, se transcribe a partir de un único gen, traducido y procesado proteolíticamente en dos subunidades: α2 (N-terminal) y δ (C-terminal) que permanecen unidas por puentes disulfuro. La subunidad dominio α2 está localizada extracelularmente, mientras que la subunidad δ está compuesta por un único segmento transmembrana y por una pequeña porción intracelular. La coexpresión del complejo α2 δ con la subunidad α1 duplica la expresión de los sitios de unión de las dihidropiridinas, las corrientes de gating y la amplitud de la ICaL (Nerbonne y Kass, 2005), desplaza la dependencia de voltaje de la activación de los canales α1-β y acelera los procesos de activación e inactivación del canal (Bangalore et al, 1996;. Gurnett et al, 1996;. Singer et al, 1991; Varadi et al., 1991; Hofmann et al., 1994; Mori et al., 1996). Se ha sugerido que la subunidad δ produciría los los cambios cinéticos, mientras que la subunidad α2 sería responsable del aumento de la expresión de los canales en la membrana (Nerbonne y Kass, 2005). Es posible que las subunidades α2δ y β conduzcan a la subunidad β1C a la membrana y permitan su adecuada localización a este nivel.

Figura 9. (A) ICa,L registrada en miocitos auriculares humanos tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. Tomada de Van Wagoner et al., 1999. (B) Canales Cav1.2, β2 y α2/δ1 (tomado de Delpón y Tamargo). Nótese la diferencia de escala temporal entre los trazos de corriente de ambos paneles.

Cinética del canal

Los canales tipo-L se activan-abren cuando se despolariza el potencial de membrana a valores positivos a -40 mV y la corriente alcanza su máxima amplitud entre 0 y +10 mV. Los canales se activan-abren muy rápidamente durante la despolarización de la membrana y persisten abiertos durante toda la fase 2 del PA cardíaco, generando una corriente de entrada de Ca2+ o ICaL. La activación y la inactivación son relativamente lentas, alcanzándose el pico máximo al cabo de 1-7 ms y se inactiva con una inact > 500 ms. La superposición de las curvas de activación e inactivación producen una "ventana de ventana" similar a la descrita para los canales de Na+. Cuando el PA cardíaca se prolonga de forma excesiva (prolongación del intervalo QT) en potencial de membrana entra en un rango de potenciales (comprendido entre -15 y -40 mV) en el que la ICaL que ha sido inactivada en gran parte durante la fase de meseta del PA puede ser parcialmente reactivada según la [Ca2+]i disminuye. Esta reactivación puede causar una despolarización neta del potencial de membrana e inducir pospotenciales tempranos y actividad desencadenada (triggered focal activity).


La inactivación del canal de Ca2+ es un proceso regulado por dos mecanismos: uno voltaje-dependiente y otro Ca2+-dependiente (Kass y Sanguinetti, 1984; Lee et al., 1985). La activación de los canales Cav1.2 utilizando Ba2+ como el ion que atraviesa los canales de Ca2+ permite registrar corrientes de entrada de Ba2+ que se activan rápidamente e inactivan lentamente a través de un mecanismo voltaje-dependiente exclusivamente. Por el contrario, cuando el ión que se conduce a través de los caanles es el Ca2 las corrientes de Ca2+ generadas se inactivan rápidamente a través de una inactivación Ca2+/calmodulina-dependiente. La calmodulina se une al extremo C-terminal de la subunidad 1C en reposo, cerca del motivo IQ y que actúa como el sensor Ca2+. Durante la despolarización, el Ca2+ entra en las células cardiacas y se une a los sitios de unión de alta afinidad en el lóbulo C-terminal de la calmodulina, que reduce la inhibición mediada por la mano EF del lazo de unión entre los dominios I-II (que representa la partícula bloqueante del canal), permitiendo su interacción con el poro y la inactivación del canal (Kim et al., 2004). Por lo tanto, la calmodulina está implicada en la inactivación Ca2+-dependiente, un mecanismo regulador fisiológico que evita una entrada excesiva de Ca2+ en los cardiomiocitos que conduciría a la necrosis cardiaca (Qin et al., 1999, Zühlke et al., 1999).

La recuperación de la inactivación es también un proceso voltaje y Ca2+ dependiente que se produce muy rápidamente cuando el potencial de membrana se repolariza casi por completo, aunque a cualquier nivel de potencial de membrana el proceso se retrasa si la [Ca2+]i permanece elevada. La combinación de una reducción lenta e incompleta de la [Ca2+]i durante la diástole y un acortamiento de los intervalos diastólicos, algo que a menudo se observa en pacientes con insufciencia cardiaca o FA, disminuye la disponibilidad ICaL.

Regulación del canal

La densidad de canales de Ca2+ tipo L aumenta con la edad y en diversas situaciones patológicas (hipertensión arterial, cardiomiopatías) y tras la ingesta de sal. Los fármacos que aumentan los niveles de AMPc (agonistas β-adrenérgicos, inhibidores de la fosfodiesterasa) activan la vía AMPc-PKA, que fosforila la subunidad 1C y aumentan la probabilidad de apertura de los canales tipo-L cardíacos y la ICaL. La activación de la PKC por ésteres de forbol o angiotensina II también aumenta la ICaL. Por el contrario, los fármacos que aumentan los niveles de GMPc (dadores de NO, acetilcolina) estimulan la PKG, que bloquea la ICa. Esta relación antagónica entre AMPc y GMPc permite al sistema nervioso vegetativo controlar la contractilidad y la frecuencia cardíacas. Los bloqueantes de los canales de Ca2+ inhiben de forma selectiva la ICaL. La acidosis, la isquemia cardíaca y la fibrilación auricular disminuyen la ICaL.

Los bloqueantes de los canales de Ca2+ se unen a puntos distintos de la subunidad α1C: las dihidropiridinas a los segmentos IIIS5 y IVS6 y éstas, así como verapamilo y diltiazem se unen al segmento IVS6 (Hockerman et al., 1997; Bodi et al., 2005). Nueve aminoácidos localizados en los segmentos IIIS5 y IIIS6 y en IVS6 contribuyen al punto de unión de las dihidropiridinas; una región de 4 aminoácidos (YMAI) en el motivo IVS6 constituye un punto de unión común para verapamilo y diltiazem. Todos los bloqueantes de los canales de Ca2+ se unen y estabilizan el canal en estado inactivo. Vepamilo y diltiazem presentan una alta afinidad por los estados activo e inactivo del canal y prolongan su reactivación, por lo que el bloqueo del canal de Ca2+ aumenta marcadamente a frecuencias cardiacas rápidas (bloqueo frecuencia-dependiente). Esta es la base de su utilización en el tratamiento de las taquiarritmias supraventriculares y en el cobntrol d ela frecuencia ventricular. Las dihidropiridinas no prolongan la reactivación, por lo que el bloqueo que producen no es frecuencia dependiente.

Canalopatías

Las mutaciones en el gen CACNA1C que codifica Cav1.2 están asociadas al síndrome de QT largo 8 (síndrome de Tymothy), síndrome de Brugada 3, síndrome de QT corto 4 y síndrome de repolarización temprana 2; mutaciones en el gen CACNA2D1 que codifica la subunidad 2 en el síndrome de QT corto 6 y en el síndrome de repolarización temprana 4 y las mutaciones en el gen CACNB2B que codifica la subunidad b2 en el síndrome de Brugada 4, el síndrome de QT corto 5 y el síndrome de repolarización temprana 3.

Referencias

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